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Tipo do documento: Dissertação
Title: Polimorfismo e expressão do gene da UCP2 no fígado de cabras em lactação
Other Titles: Polymorphism and expression of the UCP2 gene in the liver of lactating goats
Authors: Ferreira, Leonardo
Orientador(a): Soares, Maria Amélia Menck
Primeiro membro da banca: Soares, Maria Amélia Menck
Segundo membro da banca: Gasparino, Eliane
Terceiro membro da banca: Rodrigues, Marcelo Teixeira
Keywords: Alpina;Metabolismo energético;Saanem;Energetic metabolism
Área(s) do CNPq: Zootecnia
Idioma: por
Issue Date: 29-Nov-2013
Publisher: Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
Sigla da instituição: UFRRJ
Departamento: Instituto de Zootecnia
Programa: Programa de Pós-Graduação em Zootecnia
Citation: FERREIRA, Leonardo. Polimorfismo e expressão do gene da UCP2 no fígado de cabras em lactação. 2013. 41 f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) - Instituto de Zootecnia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, 2013.
Abstract: As proteínas desacopladoras de membrana desacoplam a respiração celular da produção de ATP tendo papel importante no metabolismo energético do organismo. Polimorfismos em de genes codificantes para UCPs têm sido associados a características como cobertura de gordura e ganho de peso em bovinos de corte, e à obesidade em humanos. A grande mobilização de ácidos graxos no início da lactação pode influenciar na expressão da UCP2 mostrando que esta tem papel nos processos fisiológicos desta fase. Com o presente trabalho buscamos verificar se a expressão do gene UCP2 no fígado de cabras leiteiras varia durante o período inicial da lactação e sequenciar uma parte do gene da UCP2 em caprinos verificando a existência de polimorfismo nesta região. Para isso foram utilizadas 40 cabras (Capra hircus), todas fêmeas lactantes, das raças Saanen e Alpina das quais primeiramente foram coletados 10 mL de sangue. Posteriormente, para as análises de expressão gênica, 10 desses animais foram abatidos em diferentes estágios da fase inicial de lactação (dia do parto, 7, 21, 35 dias pós-parto) e uma amostra de tecido hepático foi coletada e armazenada em RNA-holder. O sangue total foi utilizado para extração de DNA e posterior amplificação de 4 fragmentos do gene UCP2 através da reação em cadeia da polimerase, os fragmentos amplificados foram então submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% (300V a 24hrs) para avaliar pequenas diferenças de tamanho entre as amostras. Posteriormente os fragmentos foram avaliados por PCR-RFLP quanto a diferenças no padrão de corte da enzima HaeIII. Três diferentes amostras de cada fragmento da região inicial do gene foram selecionadas ao acaso para o sequenciamento de bases. A partir das amostras de tecido hepático foi realizada a extração de RNA, o qual foi utilizado nas reações de PCR em tempo real com o composto fluorescente Syber Green. Para analisar se os genótipos encontrados tem influência sobre produção de gordura e procentagem de gordura no leite, foram realizadas análises de variância e estimação de contrastes. Para avaliar se a expressão variou, nos diferentes dias pós-parto foi realizada uma análise de regressão. Na região promotora foi encontrado um polimorfismo de tamanho de fragmento que origina dois alelos, o alelo A de tamanho maior e o B, de tamanho menor, estes foram avaliados quanto a sua influência sobre a porcentagem de gordura no leite e a produção de gordura, porém nenhum dos alelos influenciou estas características. As análises de PCR-RFLP mostraram uma diferença no padrão de corte da enzima entre as amostras no éxon 2 gene dando origem a dois alelos, C e N. Estes também foram avaliados quanto à influência sobre a porcentagem de gordura no leite e produção de gordura, porém nenhuma relação foi encontrada. Após o seqüenciamento as sequências foram comparadas entre si e um polimorfismo de nucleotídeo único foi encontrado no íntron 1 porém nenhuma enzima de restrição que reconhece este polimorfismo foi encontrada, impossibilitando a genotipagem de um número maior de animais por PCR-RFLP. As reações de PCR em tempo real revelaram que expressão da UCP2 no fígado foi maior no dia do parto e diminuiu gradativamente com o avançar da lactação até os 35 dias pós-parto.
Abstract: The uncoupling proteins of mitochondrial inner membrane uncouples the cellular respiration from ATP production thus it has an important role in the energy metabolism of the organism. Polymorphisms in genes coding for UCPs have been associated with characteristics such as fat thickness and weight gain in beef cattle, and to obesity in humans. The massive mobilization of fatty acids in early lactation can influence the expression of UCP2 showing that this protein has a role in physiological processes of this phase. Thus, the purposes of this study was to verify if the expression of UCP2 gene varies during early lactation in dairy goats liver, sequence a initial part of the goat UCP2 gene and verify the existence of polymorphism in the studied region of this gene. For this we used 40 goats (Capra hircus), all lactating animals of Saanen and Alpina breed, from which 10 mL of periferic blood were collected. Thereafter, for the analysis of gene expression, 10 of these animals were slaughtered at different stages of the early lactation (day of birth, 7 , 21, 35 days post-partum) and a sample of liver tissue was collected and stored in RNA-holder. Whole blood was used for DNA extraction and subsequent amplification of four fragments of UCP2 gene by polymerase chain reaction. Amplified fragments were then subjected to electrophoresis on 12% polyacrylamide gel (300v for 24hrs) to evaluate small size differences between samples. Subsequently the fragments were analyzed by PCR-RFLP for differences in the digestion pattern of the enzyme HaeIII. Three different samples of each fragment of the initial region of the gene were randomly selected for sequencing. From the samples of liver tissue an RNA extraction was performed, and the RNA was used for the real time PCR reactions using Syber Green fluorescent compound. To assess if the genotypes found had any influence on fat production and milk fat percentage, variance and estimation of contrasts analysis were performed. To evaluate whether the expression varied at different postpartum days, a regression analysis was made. In the promoter region fragment a fragment size polymorphism that originates two alleles was found: the alelle A, larger, and the alelle B, smaller. Then the influence of these two alelles on the percentage of fat and fat production in milk were accessed, but neither allele showed influence over these characteristics. The PCR-RFLP analysis showed a difference in enzyme digestion pattern among samples in the exon 2, originating two alleles, C and N. These were also evaluated for their influence on the percentage of fat in milk and fat production, but no relationship was found. After sequencing, the sequences were compared to each other, and a single nucleotide polymorphism was found in intron 1 but no restriction enzyme that recognizes this polymorphism was found, making impossible the genotyping of a larger number of animals by PCR-RFLP technique. The reactions of real-time PCR revealed that expression of UCP2 in the liver was higher at birth and gradually decreased with advancing lactation up to 35 days postpartum.
URI: https://rima.ufrrj.br/jspui/handle/20.500.14407/14860
Appears in Collections:Mestrado em Zootecnia

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